細(xì)胞轉(zhuǎn)染在科學(xué)研究中扮演著十分重要的角色，但也是最容易被忽略的一環(huán)。轉(zhuǎn)染效率的高低不僅影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至可能導(dǎo)致得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是無(wú)效的。在多種類(lèi)型核酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，研究者們常需要進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件以達(dá)到最優(yōu)的轉(zhuǎn)染效率，特別是較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，而針對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型選擇對(duì)應(yīng)專(zhuān)業(yè)化的轉(zhuǎn)染試劑只是邁向轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功的第一步。

成立于1995年的Mirus Bio，專(zhuān)注及深耕核酸遞轉(zhuǎn)領(lǐng)域多年，從最早具有低毒性的TransIT ® -LT1到GMP級(jí)別、可用于AAV和LV生產(chǎn)的TransIT-VirusGEN® (產(chǎn)品年鑒請(qǐng)見(jiàn)圖1)。直至文稿發(fā)布時(shí)，使用Mirus產(chǎn)品發(fā)表文章已超過(guò)1萬(wàn)篇，并且發(fā)表文章及Mirus數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了超過(guò)1200種細(xì)胞類(lèi)型。

圖1 Mirus產(chǎn)品年鑒

在細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，研究者們常常會(huì)忽略轉(zhuǎn)染效率/成功率的評(píng)估，那么是否有對(duì)應(yīng)技術(shù)或者方法允許實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA/RNA的成功遞送以及細(xì)胞內(nèi)的分布狀態(tài)呢？Mirus Bio Label IT® 核酸標(biāo)記試劑盒為廣大的科研工作者提供了一個(gè)方向。Label IT® 核酸標(biāo)記試劑盒可對(duì)任何類(lèi)型核酸，進(jìn)行高效、直接的標(biāo)記，并且為on-step的實(shí)驗(yàn)操作。基于非酶反應(yīng)的標(biāo)記方法，在不損傷核酸完整性、不影響基因表達(dá)的前提下，將選擇的標(biāo)記 (熒光、生物素、地高辛等)以共價(jià)的方式連接到核酸上。

Label IT® 試劑盒有多種標(biāo)簽可供選擇，包括 Cy®3、Cy®5、CX-羅丹明、TM-羅丹明、熒光素、MFP488、地高辛、生物素和二硝基苯基(DNP)。Label IT® 核酸修飾試劑盒（胺）也可用于基于胺的功能基團(tuán)進(jìn)行DNA或RNA修飾。產(chǎn)品特點(diǎn)如下：

• 可用于標(biāo)記任何DNA或RNA模板——適用于多種應(yīng)用 (In vitro & in vivo)，如Crispr基因編輯、核酸遞轉(zhuǎn)、RNA干擾/表達(dá)實(shí)驗(yàn)、FISH、Microarray等；
• 一步法標(biāo)記——簡(jiǎn)單、輕松即可完成穩(wěn)定的模版標(biāo)記反應(yīng)；
• 可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求或應(yīng)用，調(diào)節(jié)標(biāo)記的密度——以獲得最佳檢測(cè)標(biāo)記 DNA 或RNA 的靈敏度；
• 基于共價(jià)化學(xué)反應(yīng)——對(duì)核酸殘基的修飾為永久性、無(wú)損傷的，是多種科研應(yīng)用的理想選擇。

絕大多數(shù)基于分子和生物學(xué)的In vitro 及 in vivo研究都依賴(lài)于核酸的標(biāo)記或標(biāo)簽，理想情況下，此類(lèi)標(biāo)記或標(biāo)簽不會(huì)影響核酸功能以及研究結(jié)果。因此，也發(fā)展出來(lái)多種核酸標(biāo)記方式，大致可以歸為以下兩類(lèi)：

-      化學(xué)標(biāo)記法：基于結(jié)合核酸的反應(yīng)基團(tuán)，比如Mirus Label IT® 核酸標(biāo)記試劑盒屬于此類(lèi)，并且整個(gè)反應(yīng)過(guò)程并不需要酶的參與。

Label IT® 化學(xué)標(biāo)記試劑由三個(gè)部分組成（如圖2）：

(1)      標(biāo)簽/標(biāo)記 (綠色區(qū)域)；

(2)      Linker，與核酸進(jìn)行靜電相互作用 (黃色區(qū)域)；

(3)      Label IT® 試劑以共價(jià)形式連接到核酸中活性雜原子的烷基化基團(tuán)(藍(lán)色區(qū)域)。

圖2. Label IT®標(biāo)記分子示意圖

-      基于酶反應(yīng)標(biāo)記法：通過(guò)酶促反應(yīng)，在該反應(yīng)過(guò)程中加入標(biāo)記修飾的核酸。

當(dāng)待研究的核酸加入標(biāo)記后，可通過(guò)以下兩種方式進(jìn)行檢測(cè)：

-      直接檢測(cè)：這時(shí)，標(biāo)記的核酸中包含了可用于光學(xué)、發(fā)光或產(chǎn)生熒光信號(hào)的報(bào)告分子。

-      間接檢測(cè)：標(biāo)記的核酸帶有標(biāo)簽或標(biāo)記，該標(biāo)記需要特異性的結(jié)合報(bào)告偶聯(lián)分子，如生物素結(jié)合帶有熒光標(biāo)記的鏈霉親和素，地高辛結(jié)合帶有熒光標(biāo)記的特異性抗體等。

• Label IT® 核酸標(biāo)記試劑盒——不改變核酸結(jié)構(gòu)功能

基因沉默相關(guān)功能研究在分子和細(xì)胞生物學(xué)中發(fā)揮著重要作用，化學(xué)轉(zhuǎn)染也在該研究領(lǐng)域扮演者重要角色。小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA)，常作為研究各種類(lèi)型細(xì)胞中蛋白功能核酸類(lèi)型，通過(guò)有效的knockdown從而影響基因表達(dá)。那么，加入Label IT®標(biāo)記的核酸，是否會(huì)改變核酸結(jié)構(gòu)，從而影響到后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果呢？

評(píng)估測(cè)試使用Label IT® siRNA Tracker? 試劑盒，將相同siRNA加入不同標(biāo)記 (CyTM3, CyTM5, 熒光素, CX-羅丹明 )以及沒(méi)有標(biāo)記siRNA，轉(zhuǎn)染后，可通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察到帶有標(biāo)記的siRNA?；虮磉_(dá)結(jié)果顯示，帶有不同標(biāo)記的siRNA，其目的基因表達(dá)水平近似，意味著加入Label IT®標(biāo)記的核酸，并不影響目的基因表達(dá)及功能 (圖3)。

圖3  Label IT® siRNA Tracker? 試劑盒評(píng)估測(cè)試

• Label IT® 核酸標(biāo)記試劑盒——前沿應(yīng)用舉例

應(yīng)用一：使用Label IT®技術(shù)，富集CRISPR'd細(xì)胞

Nasri 和 Mir 等人在文章中闡述了如何通過(guò) Label IT® 技術(shù)，富集 CRISPR/Cas編輯成功的細(xì)胞?；蚪M編輯實(shí)驗(yàn)面臨最大的挑戰(zhàn)之一是如何從未編輯的細(xì)胞中成功的篩選/富集出成功編輯的細(xì)胞，特別當(dāng)未被編輯的細(xì)胞相對(duì)于成功編輯的細(xì)胞，具有生長(zhǎng)/增殖優(yōu)勢(shì)，使得細(xì)胞篩選變得更加困難。

為了高效的區(qū)分經(jīng)過(guò)基因編輯及未編輯的細(xì)胞，作者在CRISPR引導(dǎo)RNA ( gRNA) 與 Cas9 形成復(fù)合物及轉(zhuǎn)染細(xì)胞前，使用Label IT®對(duì)gRNA進(jìn)行了熒光標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)流程示意圖如下：

研究結(jié)果表明，使用Label IT®標(biāo)記的gRNA 不會(huì)影響基因編輯效率，并且可通過(guò)熒光分選/富集成功編輯的細(xì)胞群。進(jìn)一步地，研究者們將該 CRISPR 實(shí)驗(yàn)流程應(yīng)用于針對(duì)多種細(xì)胞類(lèi)型的GADD45B基因編輯實(shí)驗(yàn)。根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型的不同，經(jīng)過(guò)Label IT®標(biāo)記的細(xì)胞亞群中，其成功編輯細(xì)胞占比相對(duì)于總細(xì)胞群體提了15-40%。

發(fā)表文章信息：

標(biāo)題: Fluorescent labeling of CRISPR/Cas9 RNP for gene knockout in HSPCs and iPSCs reveals an essential role for GADD45b in stress response
作者: Masoud Nasri, Perihan Mir et al.
雜志: Blood Adv, Volume 3(1), Jan 2019.
DOI: 10.1182/bloodadvances.2017015511

應(yīng)用二：使用Label IT®技術(shù)，聚焦于免疫系統(tǒng)研究

Label IT® 核酸標(biāo)記技術(shù)可用于一種新型疫苗注射方法-微針陣列(microneedle array, MNA)的表征研究。傳統(tǒng)的疫苗注射方法是通過(guò) 3 厘米以上長(zhǎng)度的針頭進(jìn)行皮下注射，而微針陣列則是由微米級(jí)針頭所組成(示意圖如下)，以無(wú)痛的方式細(xì)微的的穿透皮膚，進(jìn)入到富含免疫細(xì)胞群，可減少患者的不適感。

為了提高疫苗的效力(efficacy)，通常會(huì)將免疫刺激分子或 "激動(dòng)劑(agonists) "與疫苗的靶標(biāo)或抗原一同加入疫苗制劑中。Edwards 等人的研究表明，雙鏈 polyIC RNA 和單鏈 CpG DNA 寡核苷酸可作為微陣列中的激動(dòng)劑(agonists)。并且，研究者們認(rèn)為帶負(fù)電荷的核酸激動(dòng)劑(agonists)和帶正電荷的抗原之間的靜電相互作用，幫助了微陣列的組裝。通過(guò)使用 Label IT® Cy®3 和 Cy®5 ，分別針對(duì)以上兩種核酸類(lèi)型進(jìn)行熒光標(biāo)記，方便用于查看標(biāo)記核酸在微針上的分布，這樣就允許了研究者們按照所需要的特定比例，將兩種激動(dòng)劑均一的加入到微陣中，從而使得精確的調(diào)整微針陣列 MNA 疫苗的免疫反應(yīng)成為可能。

發(fā)表文章信息：

標(biāo)題: Tuning innate immune function using microneedles containing multiple classes of toll-like receptor agonists
作者: Camilla Edwards, Robert Oakes et al.
雜志: Nanoscale, Volume 15, Apr 2023.
DOI: 10.1039/D3NR00333G

• Label IT® 核酸標(biāo)記試劑盒-產(chǎn)品選擇

Label IT®試劑盒共有以下四種形式可供選擇，以應(yīng)對(duì)研究人員核酸標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的不同應(yīng)用場(chǎng)景需求：

• Label IT® Nucleic Acid Labeling Kits
• Label IT®Tracker? Intracellular Nucleic Acid Localization Kits
• Label IT® siRNA Tracker? Intracellular Localization Kits
• Label IT® Nucleic Acid Modifying Kits

下表總結(jié)了不同種類(lèi)Label IT®試劑盒區(qū)別：

• 更多有關(guān)產(chǎn)品常疑問(wèn)FAQ，請(qǐng)查看官網(wǎng)鏈接

• Label IT® 核酸標(biāo)記試劑盒-實(shí)驗(yàn)優(yōu)化之核酸標(biāo)記密度

理想的密度取決于被標(biāo)記的核酸類(lèi)型及下游應(yīng)用。在需要直接追蹤核酸的實(shí)驗(yàn)中，更適合較高的核酸標(biāo)記密度；而在想要維持/完整的還原標(biāo)記核酸的生物學(xué)功能的實(shí)驗(yàn)中，則更加適合較低的標(biāo)記密度。使用 Label IT® 核酸標(biāo)記技術(shù)，可以輕松調(diào)整到理想的標(biāo)記密度。

Label IT® 試劑與核酸的比例(v:w)的改變與標(biāo)記密度呈線(xiàn)性相關(guān)性(圖 4)。例如，按照說(shuō)明的初次實(shí)驗(yàn)建議，需加入 5 μl Label IT® 試劑標(biāo)記 5 μg DNA，此時(shí)v:w比例為1:1。在保證孵育時(shí)間和 DNA 量不變的條件下，如將 Label IT® 試劑的量降低為 2.5 μl 或 增加到10 μl，標(biāo)記密度將分別降低一半或增加一倍。

實(shí)驗(yàn)Tips：使用過(guò)高的 Label IT® 試劑量（超過(guò)建議量的 4 倍），可能會(huì)導(dǎo)致核酸裂解或引起 Label IT® 熒光基團(tuán)淬滅。

核酸標(biāo)記密度與所使用的 Label IT® 試劑量及反應(yīng)的孵育時(shí)間呈正線(xiàn)性相關(guān)?？?/span>通過(guò)調(diào)整反應(yīng)中 Label IT® 試劑的用量或反應(yīng)的孵育時(shí)間 (孵育溫度仍為37℃)，可輕松靈活的調(diào)整到所需要的理想標(biāo)記密度。

圖4. 核酸標(biāo)記密度與Label IT®試劑用量和反應(yīng)孵育時(shí)間成正比

實(shí)驗(yàn)Tips：如何計(jì)算核酸標(biāo)記密度，詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟及方法請(qǐng)見(jiàn)“Calculate Nucleic Acid Labeling Density”。

Mirus Bio公司介紹

Mirus成立于1995年，始終秉承著為基因遞轉(zhuǎn)提供優(yōu)化方法及高效的工具。憑借超過(guò) 25 年轉(zhuǎn)染領(lǐng)域的深根細(xì)作，獲得了多項(xiàng)技術(shù)突破，已成為核酸遞送領(lǐng)域的全球領(lǐng)導(dǎo)者和值得信賴(lài)的品牌。Mirus科學(xué)家團(tuán)隊(duì)不斷突破轉(zhuǎn)染技術(shù)的極限，推出了VirusGEN®轉(zhuǎn)染試劑與RevIT?增強(qiáng)劑，進(jìn)一步提升AAV/Lv產(chǎn)量，助力推動(dòng)生物治療藥物的降本增效，為CGT領(lǐng)域客戶(hù)賦能。

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